PEMBUATAN DAN PEWARNAAN SEDIAAN APUS

PEMBUATAN DAN PEWARNAAN SEDIAAN APUS

PEMBUATAN DAN PEWARNAAN SEDIAAN APUS A.     Pra Analitik ·    Persiapan pasien: tidak memerlukan persiapan khusus ·    Persia... 17.49

PEMBUATAN DAN PEWARNAAN SEDIAAN APUS

A.    Pra Analitik

·   Persiapan pasien: tidak memerlukan persiapan khusus

·   Persiapan sampel:

-          Darah kapiler segar akan memberikan morfologi dan hasil pewarnaan yang optimal pada sediaan apus

-          Darah EDTA (etilen diamin tetra asetat). EDTA dapat dipakai karena tidak berpengaruh terhadap morfologi eritrosit dan lekosit serta mencegah trombosit bergumpal. Tes sebaiknya dilakukan dalam waktu kurang dari 2 jam. Tiap 1 ul  EDTA digunakan untuk 1 ml darah vena

·   Prinsip tes:

Prinsip sediaan apus: dibuat apusan darah pada kaca objek.

Prinsip pewarnaan didasarkan pada sifat kimiawi dalam sel. Zat warna yang bersifat asam akan bereaksi dengan komponen sel yang bersifat alkalis, demikian pula sebaliknya. Pewarnaan sediaan apus menggunakan prinsip Romanosky yaitu menggunakan dua zat warna yang berbeda yang terdiri dari Azure B (trimethylthionin)yang bersifat basa dan eosin Y (tetrabromoflourescein) yang bersifat asam seperti yang dianjurkan oleh the International Council for Standardization in Hematology, dan pewarnaan yang dianjurkan adalah Wright-Giemsa dan May Grunwald-Giemsa (MGG).

·   Alat dan bahan

Alat:

a.       Kaca Objek 25x75 mm

b.      Batang  gelas

c.       Rak kaca objek

d.      Pipet Pasteur

            Bahan/reagen :

1.      Metanol absolut dengan kadar air kurang dari 4%, disimpan dalam botol yang tertutup rapat untuk mencegah masuknya uap air dari udara .

2.      Zat warna Wright

Zat warna Wright  ………….. 1 gr

Methanol absolut …………….600 ml

Penambahan alkohol sedikit demi sedikit, sambil dikocok dengan baik dengan bantuan  10–20 butir gelas. Tutup rapat untuk mencegah   penguapan dan disimpan ditempat  yang  gelap  selama  2 – 3 mg, dengan sering-sering dikocok, saring sebelum dipakai.

3.      Larutan dapar  pH  6,4

Na₂HPO₄         2,56 g

KH₂PO₄           6,63 g

Air suling           1     L

Sebagai pengganti larutan dapar, dapat dipakai air suling yang pHnya diatur dengan penambahan tetes demi tetes larutan Kalium bikarbonat 1% atau larutan HCl 1% sampai indikator Brom Thymol Blue ( larutan 0,04 % dalam air suling ) yang ditambahkan mencapai warna biru.

4.      Zat warna Giemsa

Zat warna giemsa         1g

Methanol absolut          10 ml

Hangatkan campuran ini sampai 50°C dan biarkan selama 15 menit, kemudian disaring. Sebelum dipakai, campuran ini diencerkan sebanyak 20 x dengan larutan dapar  pH 6,6. Untuk mencari parasit malaria, dianjurkan menggunakan larutan dapar pH 7,2 

5.   Zat warna May - Grunwald

Methylene blue dalam methanol

1% eosin dan 1 % methylene blue

B. Analitik

Cara Membuat Sediaan Apus

1.      Dipilih kaca objek yang bertepi rata untuk digunakan sbg “ kaca peng-apus “ sudut kaca objek yang dipatahkan, menurut garis diagonal untuk dapat menghasilkan sedian apus darah yang tidak mencapai tepi kaca objek

2.      Satu tetes kecil darah diletakkan pada ± 2 –3 mm dari ujung kaca objek.Kaca penghapus diletakkan dengan sudut 30 – 45 derajat terhadap kaca objek didepan tetes darah.

3.      Kaca pengapus ditarik kebelakang sehingga tetes darah , ditunggu sampai darah menyebar pada sudut tersebut.

4.      Dengan gerak yang mantap , kaca penghapus didorong sehingga terbentuk apusan darah sepanjang 3 – 4 cm pada kaca objek. Darah harus habis sebelum kaca penghapus mencapai ujung lain dari kaca objek. Apusan darah tidak bolah terlalu tipis atau terlalu tebal, ketebalan ini dapat diatur dengan mengubah sudut antara kedua kaca objek dan kecepatan menggeser. Makin besar sudut atau makin cepat menggeser, maka makin tipis apusan darah yang dihasilkan.

5.      Apusan darah dibiarkan mengering di udara. Identitas pasien ditulis pada bagian tebal apusan  dengan pensil kaca.

Sediaan Yang Baik Mempunyai Ciri – ciri :

1.      Tidak melebar sampai tepi kaca objek, panjangnya setengah sampai dua pertiga panjang kaca

2.      Mempunyai bagian yang cukup tipis untuk diperiksa, pada bagian itu eritrosit terletak berdekatan tanpa bertumpukan.

3.      Rata , tidak berlubang-lubang dan  tidak bergaris-garis

4.      Mempunyai penyebaran lekosit yang baik, tidak berhimpun pada pinggir-pinggir   atau ujung-ujung sediaan

Cara Mewarnai Sediaan Apus

I.    Pewarnaan Wright

1.   Letakkan sediaan apus pada dua batang gelas

2.      Fiksasi sediaan apus dengan metanol absolut 2 – 3 menit.

3.      Genangi sediaan apus dengan zat warna Wright biarkan 3 – 5 menit.

4.      Tambahkan larutan dapar tercampur rata dengan zat warna. Biarkan selama 5 – 10 menit.

5.      Bilas dengan air ledeng, mula-mula dengan aliran lambat kemudian lebih kuat dengan tujuan menghilangkan semua kelebihan zat warna. Letakkan sediaan hapus dalam rak dalam posisi tegak dan biarkan mengering.

II. Pewarnaan Giemsa                                                                             

1.      Letakkan sediaan apus pada dua batang gelas di atas bak tempat pewarnaan.

2.      Fiksasi sediaan apus dengan metanol absolut 2 – 3 menit.

3.      Genangi sediaan apus dengan zat warna Giemsa yang baru diencerkan. Larutan Giemsa yang dipakai adalah 5%, diencerkan dulu dengan larutan dapar. Biarkan selama 20 – 30 menit.

4.      Bilas dengan air ledeng, mula-mula dengan aliran lambat kemudian lebih kuat dengan tujuan menghilangkan semua kelebihan zat warna. Letakkan sediaan hapus dalam rak dalam posisi tegak dan biarkan mengering.

III. Pewarnaan May Grunwald – Giemsa (MGG)

1.      Letakkan sediaan apus yang telah difiksasi diatas rak pewarnaan

2.      Genangi sediaan apus dengan zat warna May Grunwald yang telah siap pakai, biarkan 2 menit

3.      Tambahkan larutan buffer pH 6.4 sama banyak dengan larutan MGG yang telah diberikan sebelumnya. Tiup agar larutan dapat tercampur rata dengan zat warna. Biarkan selama 2 menit

4.      Bilas dengan air (buang kelebihan zat warna)

5.      Genangi dengan larutan Giemsa 5% (larutan buffer pH 6.4 10 ml + Giemsa 0,5 ml) biarkan selama 10-15 menit.

6.      Bilas dengan air ledeng , mula-mula dengan aliran lambat kemudian lebih kuat dengan tujuan menghilangkan semua kelebihan zat warna. Letakkan sedian dalam sikap vertikal dan biarkan mengering sendiri.

Sumber Kesalahan

1.      Kesalahan dalam persiapan penderita, pengambilan dan penyimpanan bahan pemeriksaan

2.      Sediaan apus terlalu biru memungkinkan disebabkan  oleh apusan yang terlampau tebal , pewarnaan terlalu lama , kurang pencucian , zat warna atau larutan dapar yang alkalis.

3.      Sediaan apus terlalu merah mungkin disebabkan oleh sat warna sediaan atau larutan dapar yang asam. Larutan dapar yang terlalu asam dapat menyebabkan lekosit hancur.

4.      Bercak-bercak zat warna pada sediaan apus dapat disebabkan oleh zat warna tidak disaring sebelum dipakai atau pewarnaan terlalu lama sehingga zat warna mengering pada sedian.

5.      Morfologi sel yang terbaik adalah bila menggunakan darah tepi langsung tanpa anti koagulan. Bila menggunakan anti koagulan  sediaan apus harus dibuat segera, tidak lebih dari satu jam setelah pengambilan darah. Penggunaan antikogulan heparin akan menyebabkan latar belakang berwarna biru dan lekosit menggumpal

6.      Sediaan hapus yang tidak rata dapat disebabkan oleh kaca pengapus yang tidak bersih atau pinggirannya tidak rata atau oleh kaca objek yang berdebu, berlemak atau bersidik jari.

7.      Fiksasi yang tidak baik menyebabkan perubahan morfologi dan warna sediaan. Ini mungkin terjadi apa bila fiksasi dilakukan menggunakan methanol yang tidak absolut karena telah menyerap uap air akibat penyimpanan yang tidak baik.

8.      Fiksasi yang tidak dilakukan segera setelah sediaan apus kering dapat mengakibatkan perubahan morfologi lekosit.

·         Nilai Rujukan:

Evaluasi Eritrosit

Yang perlu diperhatikan dalam mengevaluasi eritrosit adalah morfologi, perhatikan:

-          Ukuran (size):

Diameter eritrosit yang normal (normositik) adalah 6 – 8 µm atau kurang lebih sama dengan inti limposit kecil

-          Bentuk (shape):

Bentuknya bikonkaf bundar dimana bagian tepi lebih merah daripada bagian sentralnya

-          Warna (staining):

Bagian sentral lebih pucat disebut akromia sentral yang luasnya antara 1/3 -1/2 kali diameter eritrosit

-          Benda-benda inklusi (structure intracel):

-          Distribusi : merata

Evaluasi Lekosit

Lekosit adalah sel berinti. Dalam darah tepi yang paling banyak ditemukan adalah sel polimorfonuklear netrofil (PMN). Jenis lekosit yang normal yang ditemukan dalam darah tepi adalah eosinofil (1% - 3%), bisafil (0-1%), netrofil batang (2%-6%), netrofil segmn atau sel PMN (50%-70%), limfosit (20%-40%) dan monosit (2%-8%). Dalam keadaan normal diperkirakan terdapat 1 lekosit per 500 eritrosit

Evaluasi Trombosit

Diameter trombosit adalah 1-3 µm, tidak berinti, mempunyai granula dan bentuknya reguler. Perkiraan jumlah trombosit dalam keadaan normal diperkirakan terdapat  1 trombosit per 15 – 20 eritrosit atau 5 – 15 per lapangan pandang imersie

C. Pasca Analitik

Evaluasi Eritrosit

Dengan pemeriksaan ini dapat ditemukan berdasarkan morfologi yakni

-          Anemia Mikrositik Hipokrom misalnya pada penderita defisiensi Fe.

-          Anemia Normositik Normokrom misalnya pada pendarahan akut.

-          Anemia Mikrositik misalnya pada defisiensi Vit. B12 dan asam folat.

Bentuk eritrosit hemolisis :

-          Morfologi secara umum adalah polikromatofilik, makrosit, dansel eritrosit berinti. Bentuk morfologi khusus bervariasi tergantung etiologi kerusakan eritrosit:

·         Akantosit pada abetalipoproteinemia, sirosis, uremia, Haemolytic Uremic Syndrome (HUS), anemia hemolitik.

·         Ekinosit pada abetalipoproteinemia, sirosis, uremia HUS,

·         Sel Target pada Hb C atau E, penyakit hati, ikterus obstruktif, talasemia, pasca splenektomi.

·         Sel tetes Air Mata pada mielofibrosis, talasemia, anemia hemolitik, mieloftisis.

·         Sickle Cell pada sickle cell anemia.

·         Sferosit pada hemolisis didapat maupun herediter.

·         Ovalosit pada ovalositosis herediter.

·         Sistosit pada talasemia, anemia hemolitik, mikroangiopati.

Distribusi abnormal eritrosit

Rouleaux formation pada multipel mieloma, makroglobulinemia Waldenstorm.

      Benda-benda inkuilis dalam eritrosit

-          Normoblast pada pendarahan akut, hemolisis berat mielofibrosis, asplenia, leukimia, mieloftsis.

-          Basophilic Stippling anemia sindroma Mielodisplasia.

-          Howell Jolly Bodies pada anemia megaloblastik, asplenia, hemolisis berat.

-          Cabot’s, Ring pada hemolisis berat.

-          Heinz Bodies pada talasemia, anemia hemolitik karena obat, leukemia

-          Parasit : plasmodium malaria, biasanya disertai dengan tanda-tanda hemolitik.

Evaluasi Lekosit

Pada apusan ditemukan tanda infeksi seperti persentase jumlah netrofil, limfosis meningkat, hipersegmentasi, granulasitoksis, dan vacuolisasi sitoplasma.

Evaluasi Trombosit

Trombositosis dapat ditemukan pada

Mieloproliferatif, pendarahan akut, infeksi, penyakit inflamasi, Hodgkin, trombosis vena, post splenektomi.

Trombositopenia dapat ditemukan pada :

Radiasi eritroleukimia, anemia megaloblastik, giant hemangioma,Thrombotic Purpura (TTP), Disseminated Intravasucular oagulation (DIC), purpura trombositopenia karena obat, pasca tranfusi, SLE, Immunologic, Thrombocytopenia Purpura (ITP)

Trombosit besar dapat ditemukan pada: May Hegglin anomaly, Sindroma Mielodisplasia, AML.