METODE PEMBUATAN SEDIAAN FIKSASI DEHIDRASI DAN PENJERNIHAN

05.22

1. PEMBUATAN SEDIAAN

1. Metode Oles (Smear Methods)

Adalah suatu pembuatan sediaan dengan jalan mengoles / membuat selaput (film) dari substansi yang berupa cairan atau bukan cairan diatas gelas benda yg bersih dan bebas lemak, untuk selanjutnya kmd difiksasi, diwarnai dan ditutup dengan gelas penutup.

Bahan yang sering dibuat sediaan oles yaitu darah, nanah / jaringan-jaringan tertentu. Cara ini sangat baik untuk mempelajari sitologi darah, sumsum tulang merah, eksudat dari bermacam-macam jaringan yg meradang.

Contoh pembuatan sediaan oles :

· Pembuatan sediaan darah tipis

· Pembuatan sediaan oles dari jaringan

· Pembuatan sediaan darah tebal

· Pembuatan sediaan nanah yang tebal (nanah diencerkan dahulu dgn serum / cairan lain, bila keruh, disentrifugasi, endapan diencerkan lagi, siap dioleskan)

Beberapa pewarnaan sediaan oles : Pewarnaan Giemsa, Pewarnaan May Grunwald (larutan eosin-methylen blue dlm methyl alkohol), Pewarnaan Pappenheim, Pewarnaan Wright.

2. Metode Rentang (Spread)

Adalah suatu metode pembuatan sediaan dengan cara merentangkan suatu jaringan pada permukaan gelas benda sehingga dapat diamati dengan mikroskop.

Bahan yang dibuat jaringan yang tipis, misalnya pleura, mesenterium, peritoneum, pericardium, dsb. Dapat diamati tanpa pewarnaan / dengan pewarnaan Mallory-Acid Fuchsin : Hematoksilin ; Azure II-Eosin.

3. Metode Pencet (Squash)

Adalah metode untuk mendapatkan suatu sediaan dengan cara memencet suatu potongan jaringan atau suatu organisme secara keseluruhan sehingga didapatkan suatu sediaan yang tipis yang dapat diamati dengan mikroskop.
Digunakan untuk jaringan yang sel-selnya mudah lepas, misalnya lien, sumsum tulang, tumor seluler dll. Diambil ± 1 mm. Pewarnaan yang digunakan yaitu Larutan Carmine.

4. Metode Supravital

Adalah metode untuk mendapatkan sediaan dari sel / jaringan yang hidup.

Zat warna yang digunakan yaitu Janus Green, Neutral Red, Methylen Blue dengan konsentrasi tertentu.

Bahan yangdigunakan diantaranya darah, epithelium mukosa mulut.

5. Metode Irisan

Suatu metode pembuatan sediaan dengan jalan membuat suatu irisan dengan tebal tertentu sehingga dapat diamati dengan mikroskop.

Ada 2 macam metode irisan :

· Metode irisan dengan tangan

· Metode irisan dengan mikrotom

· Metode Irisan dengan Mikrotom

Keuntungan : tebal irisan dapat diatur menurut tujuan dan kehendak pemeriksa.

v Macam-macam Mikrotom:

o Mikrotom geser (Sliding Microtome)

Disini jaringan tetap pada tempatnya sedangkan pisaunya yang bergerak. Jaringan yang akan dipotong adalah jaringan yang tanpa penanaman (embedding) terlebih dahulu. Irisan dikumpulkan pada wadah berisi air, disini pisau dan kuas harus basah.

o Mikrotom beku (Freezing Microtome)

Alat dihubungkan dengan tabung yg berisi CO2 dingin melalui suatu pipa karet. Disini jaringan tetap berada pada tempatnya, sedang pisau yang bergerak ke muka dan ke belakang. Digunakan dalam sediaan irisan dengan metode beku.

o Mikrotom putar (Rotary Microtome)

Disini pisau tetap pada tempatnya sedangkan jaringan yang bergerak keatas dan kebawah. Digunakan untuk pembuatan sediaan irisan dengan metode paraffin. Cara ini banyak digunakan karena irisan yang diperoleh lebih tipis dibanding metode lain dan hampir semua jaringan dapat diiris dengan mikrotom ini. Disini irisan jaringan yang terjadi satu sama lain saling bergandengan sehingga terbentuk pita yang panjang.

2. FIKSASI

Proses/langkah pertama dalam menyiapkan materi segar untuk pembuatn sediaan Histologi adalh Fiksasi. Fiksasi merupakan langkah yang penting dalam pembuatan sediaan utuh maupun sayatan.

v Tujuan fiksasi :

· Menghentikan proses-proses metabolik sel secara tepat

· Mencegah terjadinya perubahan-perubahan yang bersifat regresif

· Mengawetkan bahan-bahan sitologis dan Histologis

· Mempertahankan bentuk aktual bahan biologis

· Mengeraskan (Konsistensi bahan lunak)

· Memberi kemungkinan adanya perbedaan optik diantara jaringan

v Sifat bahan Fiksatif yang dapat Difiksasi

· Memiliki daya Penetrasi yang baik dalam Jaringan

· Mampu mengkoagulasi isi sel dengan baik

· Mampu melindungi jaringan terhadap Distorsi (perubahan bentuk)

· Mampu membuat isi sel menjadi tampak berbeda dan jelas

v Beberapa macam Fiksatif ,ada yang bersifat umum ada pula yang bersifat khusus:

· Fiksasi Tunggal – Bahan pembuatan fiksatif campuran

Asam asetat ( CH3COOOH), Aseton (CH3COCH3), Kromiun Trioksida(CRO3), asam kromat, Alkohol, Aldehida(HCHO), Merkuri Klorida (HgCL2), Osmium tetroksida (OsO4), Asam Pikrat [C6H2(NO2)3OH], Kalium Dikromat (K2Cr2O7),Asam trikoloasetat (CCL3COOH)

· Fiksasi Campuran – Kombinasi beberapa fiksatif tunggal

Larutan Mueller, Orth, Zenker, Helly (Formol Zerker), Heidenhain, Lavdowsky, Mann, Bouin, Allen B, GilsonBensay,A0B, Regaud, Bianco, Gate, Navashin, Lar.Carnoy, Lar.Alkohol-Formalin-Asetat (AFA), Lar. Kolmer, Petrunkewitsch

v Faktor-faktor yang berperan dalam memfiksasi:

· Buffer (pH)

· Suhu : rendah akan mencegah aotolysis

· Daya penetrasi: Bila rendah ,maka potongan jaringan harus tipis

· Perubahan volume: Misalkan karena perubahan permeabilitas

· Osmolalitas perubahan Fiksatif: bila Hipotonis maka sel akn mengerut, sebaliknya bila Hipertonis maka sel akn mengembang.

· Penambahan Deterjen agar larutan Fiksatif mudah masuk

· Konsentrasi Harga/ Penghematan

· Waktu Fiksatif : Tergantung sifat jaringan fiksatif ,serta ukuran jaringan

3. DEHIDRASI

Tujuan Dehidrasi adalah untuk menarik air yang terdapat dalam jaringan setelah fiksasi. Dehidrasi juga memiliki fungsi mencuci (washing) dan bias membuat jaringan menjadi kokoh dan menjadi keras dan rapuh. Bahan yang digunakan untuk pendehidrasi Alkohol, Dioksan(Kombinasi Dehidrasi dan Infiltrasi) dan n-Butil Alkohol (Kombinasi dehidrasi dan penjernihan).

Dehidrasi dilakukan secara bertahap (seri,dengan persentasi yang meningkat) yang terbaik adalah dengan alcohol 50% dan meningkat menjadi Alkohol 60%,70%,dan 80%. Pada saat jaringan berada dalam alcohol 80% dehidrasi dapt dihentikan dalm waktu yang lama hingga jaringan siap untuk diproses selanjutnya.

Waktu yang dibutuhkan dalm setiap persentasi alcohol tergantung pada besarnya dan karakteristik jaringan. Pada umumnya setiap alkohol direndam selama 30- 45 menit. Setelah jaringan melewati alcohol 80% ,maka dehidrasi berikutnya di alm alcohol 90% dan 100%.tidak boleh melebihi beberapa jam ( tidak terlalu lama karena alkohol100% sangat mengeraskan /merapuhkan jaringan).

4. PENJERNIHAN

Clearing merupakan tahap transisi bila menggunakan Parafin sebagai media tanam.zat yang digunakan dalm clearing harus dapat menarik keluar alkohol (bahan dehidrasi) sekaligus larut dalam parafin.

Ada 3 jenis penjernihan yaitu:

1. Penjernihan dengan Xilol dan Toluol

Dalam tahap ini alkohol absolut jaringan dipindahkan ke dalam campuran alkohol-Xilol selam 30 menit, kemudian ke dalam Xilol pertama (30-60menit) lalu ke dalm xilol kedua 30 menit dan akhirnya dipindahkan ke dalm parafin lembut (Sdoft parafin) yang sudah dicairkan di dalam oven.

Pada saat menguap, xilol meninggalkan rongga udara dalam jaringan sehingga akan sulit difiltrasi dengan parafin.Toluol jauh lebih menguntungkan jika dibandingkan dengan xilol karena tidak mengeraskan jaringan secara berlebih dan tidak terlalu cepat menguap.

2. Penjernihan dengan Kloroform

Jika kloroform digunakn sebagai penjernih ,maka jaringan pertama harus dipindahkan ke dalam campuran alkohol-klorofoam sampai jaringan tenggelam ke dasar kontainer.tenggelamnya jaringan ini karena menyerap klorofoam, makin banyak klorofoam yang diserap makin berat jaringan.

3. Penjernihan dengan minyak cedar atau metil salisilat

Jika metil salisilat digunakan sebagai penjernih, jaringan dari alkohol 95% dapat dipindahkan langsung dengan minyak cedar. Jika kemudian jaringan ini akn diembedding dengan parafin,jaringan harus menempuh tahap transisi dahulu, yaitu di dalm xilol.