CARA IDENTIFKASI KAPANG METODE SDS-PAGE

CARA IDENTIFKASI KAPANG METODE SDS-PAGE

  Berikut ini menjelaskan tentang Cara isolasi kapang  Aspergillus spp, cara identifikasi kapang  Aspergillus spp, cara pembuatan gel SDS-PA... 22.18

 

Berikut ini menjelaskan tentang

Cara isolasi kapang Aspergillus spp, cara identifikasi kapang Aspergillus spp, cara pembuatan gel SDS-PAGE, cara running SDS-PAGE

1.      Isolasi Kapang Aspergillus spp

Isolasi kapang Aspergillus spp dilakukan pada media PDA (Potato Dextrose Agar) sintesis dengan menggunakan cawan petri :

1.     Disiapkan alat dan bahan.

2.     Ditimbang media PDA sebanyak 5,85 gr lalu dipindahkan kedalam erlenmeyer kemudian ditambahkan aquadest sebanyak 150 mL

3.     Dihomogenkan larutan dengan cara dipanaskan dan diaduk selama proses pemanasan sampai mendidih diatas hot plate

4.     Disterilisasi media yang telah dibuat pada suhu 121^oC selama + 15 menit

5.     Dikeluarkan media PDA dan diletakan dalam laminar air flow

6.     Dipipet 900 µL aquadest lalu ditambahkan 100 µL sampel ditabung eppendorf, homogenkan

7.     Dituang sampel kedalam cawan petri bersamaan dengan medianya, dihomogenkan membentuk angka 8

8.      Dibiarkan media sampai memadat dengan sempurna didalam cawan petri

9.      Diinkubasi media kedalam inkubator pada suhu 37^oC pada posisi terbalik selama 24 jam.

2.      Idetifikasi Kapang Aspergillus spp

Identifikasi kapang Aspergillus flavus dilakukan dengan cara makroskopis. Identifikasi jamur secara makroskopis dengan cara melihat warna koloni jamur, tekstur koloni, zonasi koloni, dan bentuk koloni.

3.      Pemeriksaan dengan SDS-PAGE

Pemeriksaan yang dilakukan pada penelitian ini adalah sebagai berikut :

a.  Preparasi Sampel

1.  Diukur konsentrasi sampel dengan menggunakan metode Bradford atau Lowry.

2.  Setelah diperoleh konsentrasi yang diinginkan maka tahap berikutnya adalah dengan menambahkan sampel buffer yaitu laemmli sampel buffer yang sudah ditambahkan (50 µL β- mercaptoetanol + 950 µL laemmli sampel buffer) sebanyak 1:1

3.  Selanjutnya, protein yang sudah ditambahkan laemmli sampel buffer dipanaskan dalam water bath atau heat block (>70^oC) selama 3-5 menit untuk mendenaturasi protein dan mempercepat reaksi pada sampel yang dianalisis.

4.  Setelah dingin, disimpan pada suhu 20ºC bila sampel tidak langsung dipakai.

b.  Pembuatan Gel SDS-PAGE

1.  Disiapkan alat yang akan digunakan untuk mencetak gel seperti spacer plate, short plate, dan casting gel system.

2.  Dirakit alat untuk membuat gel, dengan memasukkan spacer dan short plate pada casting gel secara merata untuk menghindari kebocoran.

3.  Pertama dibuat larutan gel pemisah (separating gel) 12% dengan komposisi sebagai berikut:

-       Dimasukkan 3 mL stock 30% akrilamide/Bis dalam tabung.

-       Ditambahkan 1,875 mL 1,5 M tris pH 8.8 kedalam tabung, shaker perlahan- lahan.

-       Ditambahkan aquabides 5,03 mL, shaker perlahan-lahan kembali.

-       Ditambahkan 75 µL 10% SDS (Sodium Dodecyll Sulphate), shaker kembali.

-       Dimasukkan 38 µL 10% APS (Amonium Sulphate).

-       Ditambahkan TEMED 3,8 µL, shaker kembali.

-       Segera dituangkan kedalam cetakan, ditunggu hingga ± 30 menit.

4. Dibuat larutan untuk stacking gel 4%, dengan komposisi    sebagai berikut:

-       Dimasukkan 500 µL  30% Akrilamide/Bis dalam tabung.

-       Ditambahkan 945 µL 0,5 M tris pH 6,8, shaker perlahan-lahan.

-       Ditambahkan aquabides 2,250 mL, shaker perlahan-lahan kembali.

-       Ditambahkan 38 µL 10% SDS (sodium dodesil sulfate), shaker kembali.

-       Dimasukkan 20 µL 10 % APS (Amonium persulfate).

-       Ditambahakan TEMED 3,8 µL, shaker kembali.

-       Segera dituangkan diatas separating gel.

-       Dipasang comb, dan ditunggu hingga gel memadat.

- Setelah gel membeku, gel siap digunakan untuk proses SDS-PAGE.    

c. Running SDS-PAGE

1.  Dimasukkan gel yang telah dibuat ke dalam chamber yang terdapat pada mini protein tetra cell, ditambahkan running buffer kemudian comb dibuka.

2.  Sampel protein dan marker dimasukkan ke dalam sumur/well.

3.  Setelah marker protein dan sampel protein dimasukkan, ditutup chamber mini protein tetra cell. Dihubungkan kabel mini protein tetra cell dengan power supply.

4.  Di running gel pada 100-120 V , selama 60 - 90 menit , kecepatan arus 50 mA.

5.  Setelah selesai, dimatikan power supply, lalu diangkat kaca yang mengandung gel kemudian dikeluarkan gel menggunakan pembuka gel yang sudah disediakan.

6.  Untuk verifikasi hasil SDS-PAGE dapat dilakukan dengan proses pewarnaan dengan coomasie ble atau menggunakan coomassie Bio-Safe.

7.  Setelah proses pewarnaan, dilakukan langkah destaining/pencucian gel. Untuk penggunaan coomasie blue digunakan larutan destaining dengan komposisi :

-       Methanol 100 mL

-       Asam asetat glasial 100 mL

-       Aquades 100  mL

-       Untuk penggunaan coomasie bio safe bisa menggunakan aquades.

8.  Setelah itu divisualisasi bisa di lakukan langsung tanpa menggunakan imaging sistem.

lihat cara pemeriksaan malaria

PEMERIKSAAN TBC Mycobacterium tubercolosis

PEMERIKSAAN TBC Mycobacterium tubercolosis

Tinjauan Tentang Pemeriksaan Mycobacterium tubercolosis a.     Pemeriksaan Mikroskopik Hasil pembacaan mikroskopis digunakan untuk diagn... 05.14

Tinjauan Tentang Pemeriksaan Mycobacterium tubercolosis

a.    Pemeriksaan Mikroskopik

Hasil pembacaan mikroskopis digunakan untuk diagnosis dan mengetahui tingkat kesakitan. BTA dinyatakan positif apabila pada lapang pandang terlihat batang berwarna merah atau merah muda dengan latar belakang biru bila diwarnai dengan pewarnaan tahan asam atau Ziehl-Neelsen. BTA biasanya berbentuk batang, namun kadang-kadang bisa mirip kokus, filamentous, (seperti benang), atau berkelompok.  (Amin dkk, 2009)

Menurut Aditama (2006), pemeriksaan dahak berfungsi untuk menegakkan diagnosis, menilai keberhasilan pengobatan dan menentukan potensi penularan. Pemeriksaan dahak secara mikroskopik dilakukan dengan cara sebagai berikut:

1)     Pengumpulan Dahak

Spesimen dahak dikumpulkan atau ditampung dalam pot dahak bermulut lebar, berpenampang 6 cm atau lebih dengan tutup berulir, tidak mudah pecah dan tidak bocor yang telah diberi label atau nomor urut sediaan dahak. Pemeriksaan dahak untuk penegakan diagnosis dilakukan dengan mengumpulkan 3 spesimen dahak yang dikumpulkan dalam dua hari kunjungan yang berurutan berupa Sewaktu-Pagi-Sewaktu (SPS).

2)     Pemberian Nomor Identitas Sediaan

a)     Kaca sediaan dipengang pada kedua sisinya untuk menghindari sidik jari pada badan sediaan.

b)     Setiap kaca sediaan diberi nomor identitas sesuai dengan identitas pada pot dahak dengan menggunakan spidol permanen atau pensil kaca.

c)     Pemberian nomor identitas sediaan bertujuan untuk mencegah kemungkinan tertukarnya sediaan

3)     Pembuatan Preparat

Pilih bagian dahak yang kental, warna kuning kehijauan, ada pus, darah atau ada perkejuan. Ambil sedikit bagian tersebut dengan menggunakan ose yang sebelumnya dibakar dulu sampai pijar, kemudian didinginkan. Ratakan diatas kaca obyek dengan ukuran ±2-3 cm. Hapusan sputum yang dibuat jangan terlalu tebal atau tipis. Keringkan dalam suhu kamar. Ose sebelum dibakar dicelupkan dulu kedalam botol berisi campuran alkohol 70% dan pasir dengan perbandingan 2 : 1 dengan tujuan untuk melepaskan partikel yang melekat pada ose (untuk mencegah terjadinya percikan atau aerosol pada waktu ose dibakar yang dapat menularkan bakteri tuberculosis). Rekatkan/ fiksasi dengan cara melakukan melewatkan preparat diatas lidah api dengan cepat sebanyak 3 kali selama 3-5 detik. Setelah itu sediaan langsung diwarnai dengan pewarna Ziehl Neelsen

4)     Pembuatan Ziehl Neelsen

Pada dasarnya prinsip pewarnaan Mycobacterium yang dinding selnya tahan asam karena mempunyai lapisan lemah atau lilin sehingga sukar ditembus cat. Oleh pengaruh phenol dan pemanasan maka lapisan lemak dapat ditembus cat basic fuchsin. Pada pengecatan Ziehl Neelsen setelah BTA mengambil warna dari basic fuchshin kemudian dicuci dengan air mengalir, lapisan lilin yang terbuka pada waktu dipanaskan akan merapat kembali karena terjadi pendinginan pada waktu dicuci. Sewaktu dituang dengan asam sulfat dan alkohol 70% atau HCI alkohol, warna merah dari basic fuchsin pada BTA tidak akan dilepas/ luntur. Bakteri yang tidak tahan asam akan melepaskan warna merah, sehingga menjadi pucat atau tidak bewarna. Akhirnya pada waktu dicat dengan Methylien Blue BTA tidak mengambil warna biru dan tetap merah, sedangkan bakteri yang tidak tahan asam akan mengambil warna biru dari Methylien Blue

5)     Pengecatan Basil Tahan Asam

Letakkan sediaan diatas rak pewarna, kemudian tuang larutan Carbol Fuchsin sampai menutupi seluruh sediaan. Panasi sediaan secara hati-hati diatas api selama 3 menit sampai keluar uap, tetapi jangan sampai mendidih. Biarkan selama 5 menit (dengan memakai pinset). Cuci dengan air mengalir, tuang HCL alkohol 3% (alcohol asam) sampai warna merah dari fuchsin hilang. Tunggu 2 menit. Cuci dengan air mengalir, tuangkan larutan Methylen Blue 0,1% tunggu 10-20 detik. Cuci dengan air mengalir, keringkan di rak pengering.

6)     Pengamatan dengan Mikroskop

Setelah preparat terwarnai dan kering, dilap bagian bawahnya dengan kertas tissue, kemudian sediaan ditetesi minyak imersi dengan 1 tetes diatas sediaan. Sediaan dibaca mikroskop dengan perbesaran kuat. Pemeriksaan dimulai dari ujung kiri dan digeser ke kanan kemudian digeser kembali ke kiri Diperiksa 100 lapang pandang (kurang lebih 10 menit). Pembacaan dilakukan secara sistematika, dan setiap lapang pandang dilihat, bakteri Mycobacterium tuberculosis berwarna merah berbentuk batang lurus atau bengkok, terpisah, berpasangan atau berkelompok dengan latar belakang biru (Supriyadi, 2003)

Lihat disini cara menggunakan mikroskop

b.    Gen Expert

Tes cepat molekuler GeneXpert MTB/RIF merupakan pemeriksaan molekuler menggunakan catridge berdasarkan Nucleic Acid Amplification Test (NAAT) yang secara otomatis mendeteksi M.tuberculosis dan sekaligus mendeteksi  resistensi M.tuberculosis terhadap rifampisin.

Rifampisin merupakan penanda pengganti (surrogate marker) yang mewakili suatu MDR-TB , dibuktikan dari beberapa hasil penelitian yang menyatakan lebih dari 90% penderita TB yang resisten rifampisin, juga mengalami resistensi terhadap isoniazid36-39. Gen rpoB mengkode subunit-β ribonucleic acid (RNA) polimerase yang bekerja berikatan dengan rifampisin, yang merupakan komponen penting dalam proses transkripsi. Sintesis Protein akan terhambat disebabkan terhambatnya transkripsi RNA tersebut. Bila terjadi mutasi pada gen rpoB, akan terjadi resistensi rifampisin dimana obat rifampisin tidak dapat berikatan dengan subunit-β RNA polimerase. Beberapa peneliti mendapatkan >95% isolat M. tuberculosis yang resisten terhadap rifampisin mengalami mutasi pada gen rpoB, sehingga regio ini merupakan target yang ideal untuk memeriksa resistensi rifampisin secara molecular

Sistem GeneXpert diluncurkan tahun 2004 dimana pemeriksaan ini menggunakan metode heminested real-time polymerase chain reaction (PCR) assay untuk mendeteksi mutasi pada regio hot spot rpoB, kemudian diperiksa dengan beacon molecular sebagai probe. Pengujian dilakukan pada platform tes cepat molekuler GeneXpert MTB/RIF, mengintegrasikan sampel yang akan diolah dalam cartridge plastik sekali pakai dan secara automatis mendeteksi melalui 3 proses yaitu persiapan sampel, amplifikasi dan deteksi. Cartridge ini berisi semua reagen yang diperlukan untuk dapat melisiskan bakteri, ekstraksi asam nukleat, amplifikasi, dan deteksi gen yang sudah diamplifikasi. Pemeriksaan ini tidak memerlukan tenaga ahli yang khusus karena pemeriksaan ini bersifat otomatis dan hasil dapat diperoleh kurang dari 2 jam.

Sputum yang terkontaminasi dicampurkan dengan reagen sampel (RS) yaitu berupa natrium hidroksida dan isopropanolol. RS ditambahkan ke sampel dan diinkubasi pada suhu kamar selama 15 menit. Langkah ini dirancang untuk mengurangi kelangsungan hidup M. tuberculosis di sputum setidaknya 106 kali lipat untuk mengurangi risiko Biohazard. Sampel yang telah dicampur dengan SR tersebut kemudian secara manual ditransfer ke cartridge kemudian dimasukkan ke dalam mesin. Pengolahan selanjutnya sepenuhnya otomatis (Danusantoso, 1999)

Sampel yang secara otomatis diputar dan di filter sehingga M.Tb akan terpisah dari sampel sputum. Kemudian inhibitor mencuci sel organisme yang ditangkap dengan buffer kemudian platform akan melisiskan menggunakan sumber energi ultrasonik sehingga DNA dari M.Tb akan terlepas dan dialirkan melalui saringan membran. Lalu DNA dicampur dengan reagen PCR kering dan dipindahkan ke dalam tabung reaksi untuk amplifikasi dan dideteksi

Dalam salah satu laporan penelitian, sampel sputum pasien non-TB ditambahkan kuman M.Tb 10-300 CFU/ml sputum kemudian dilakukan tes cepat molekuler GeneXpert MTB/RIF, ditemukan batas terdeteksi kuman adalah 131 CFU/ml sputum. Bila dibandingkan dengan pemeriksaan apusan langsung sputum yang diperkirakan memiliki batas terdeteksi 10.000 CFU/ml sputum dan batas terdeteksi pada kultur diperkirakan 10-100 CFU/ml sputum. Hal tersebut membuktikan bahwa tes cepat molekuler GeneXpert MTB/RIF memiliki sensitivitas lebih besar dari pemeriksaan apusan sputum dan memiliki sensitivitas yang mendekati pemeriksaan kultur

Menurut laporan penelitian lainnya, pada sampel sputum ditambahkan 20 jenis NTM yang telah di isolasi (termasuk 16 spesies yang menyebabkan penyakit pada manusia). kemudian dilakukan tes cepat molekuler GeneXpert MTB/RIF dan didapatkan hasil negatif pada semua sampel. Hal ini membuktikan bahwa GeneXpert memiliki spesifisitas yang cukup tinggi. Akan tetapi apabila dilakukan percobaan dimana sampel sputum ditambahkan NTM dalam konsentrasi tinggi lalu dicampur kuman M.Tb dalam konsentrasi rendah tes cepat molekuler GeneXpert MTB/RIF mengalami penurunan sensitivitas.

TERIMAKASIH SUDAH BERKUNJUNG KE BLOG KAMI ^^