05.14
Tinjauan Tentang Pemeriksaan Mycobacterium tubercolosis
a. Pemeriksaan
Mikroskopik
Hasil pembacaan mikroskopis digunakan untuk diagnosis dan
mengetahui tingkat kesakitan. BTA dinyatakan positif apabila pada lapang
pandang terlihat batang berwarna merah atau merah muda dengan latar belakang
biru bila diwarnai dengan pewarnaan tahan asam atau Ziehl-Neelsen. BTA biasanya
berbentuk batang, namun kadang-kadang bisa mirip kokus, filamentous, (seperti
benang), atau berkelompok. (Amin
dkk, 2009)
Menurut Aditama (2006), pemeriksaan dahak berfungsi untuk
menegakkan diagnosis, menilai keberhasilan pengobatan dan menentukan potensi
penularan. Pemeriksaan dahak secara mikroskopik dilakukan dengan cara sebagai
berikut:
1) Pengumpulan Dahak
Spesimen dahak dikumpulkan atau ditampung dalam pot dahak bermulut lebar, berpenampang 6 cm atau lebih dengan tutup berulir, tidak mudah pecah dan tidak bocor yang telah diberi label atau nomor urut sediaan dahak. Pemeriksaan dahak untuk penegakan diagnosis dilakukan dengan mengumpulkan 3 spesimen dahak yang dikumpulkan dalam dua hari kunjungan yang berurutan berupa Sewaktu-Pagi-Sewaktu (SPS).
2) Pemberian Nomor Identitas Sediaan
a) Kaca
sediaan dipengang pada kedua sisinya untuk menghindari sidik jari pada badan
sediaan.
b) Setiap
kaca sediaan diberi nomor identitas sesuai dengan identitas pada pot dahak dengan
menggunakan spidol permanen atau pensil kaca.
c) Pemberian
nomor identitas sediaan bertujuan untuk mencegah kemungkinan tertukarnya sediaan
3) Pembuatan
Preparat
Pilih bagian dahak yang kental, warna kuning kehijauan, ada pus, darah atau ada perkejuan. Ambil sedikit bagian tersebut dengan menggunakan ose yang sebelumnya dibakar dulu sampai pijar, kemudian didinginkan. Ratakan diatas kaca obyek dengan ukuran ±2-3 cm. Hapusan sputum yang dibuat jangan terlalu tebal atau tipis. Keringkan dalam suhu kamar. Ose sebelum dibakar dicelupkan dulu kedalam botol berisi campuran alkohol 70% dan pasir dengan perbandingan 2 : 1 dengan tujuan untuk melepaskan partikel yang melekat pada ose (untuk mencegah terjadinya percikan atau aerosol pada waktu ose dibakar yang dapat menularkan bakteri tuberculosis). Rekatkan/ fiksasi dengan cara melakukan melewatkan preparat diatas lidah api dengan cepat sebanyak 3 kali selama 3-5 detik. Setelah itu sediaan langsung diwarnai dengan pewarna Ziehl Neelsen
4) Pembuatan Ziehl Neelsen
Pada dasarnya prinsip pewarnaan Mycobacterium yang
dinding selnya tahan asam karena mempunyai lapisan lemah atau lilin sehingga
sukar ditembus cat. Oleh pengaruh phenol dan pemanasan maka lapisan lemak dapat
ditembus cat basic fuchsin. Pada pengecatan Ziehl
Neelsen setelah BTA mengambil warna dari basic fuchshin kemudian
dicuci dengan air mengalir, lapisan lilin yang terbuka pada waktu dipanaskan
akan merapat kembali karena terjadi pendinginan pada waktu dicuci. Sewaktu
dituang dengan asam sulfat dan alkohol 70% atau HCI alkohol, warna merah
dari basic fuchsin pada BTA tidak akan dilepas/ luntur.
Bakteri yang tidak tahan asam akan melepaskan warna merah, sehingga menjadi
pucat atau tidak bewarna. Akhirnya pada waktu dicat dengan Methylien
Blue BTA tidak mengambil warna biru dan tetap merah, sedangkan bakteri
yang tidak tahan asam akan mengambil warna biru dari Methylien Blue
5) Pengecatan Basil Tahan Asam
Letakkan sediaan diatas rak pewarna, kemudian
tuang larutan Carbol Fuchsin sampai menutupi seluruh sediaan.
Panasi sediaan secara hati-hati diatas api selama 3 menit sampai keluar uap,
tetapi jangan sampai mendidih. Biarkan selama 5 menit (dengan memakai pinset).
Cuci dengan air mengalir, tuang HCL alkohol 3% (alcohol asam) sampai warna
merah dari fuchsin hilang. Tunggu 2 menit. Cuci dengan air
mengalir, tuangkan larutan Methylen Blue 0,1% tunggu 10-20
detik. Cuci dengan air mengalir, keringkan di rak pengering.
6) Pengamatan dengan Mikroskop
Setelah preparat terwarnai dan kering, dilap bagian bawahnya dengan kertas tissue, kemudian sediaan ditetesi minyak imersi dengan 1 tetes diatas sediaan. Sediaan dibaca mikroskop dengan perbesaran kuat. Pemeriksaan dimulai dari ujung kiri dan digeser ke kanan kemudian digeser kembali ke kiri Diperiksa 100 lapang pandang (kurang lebih 10 menit). Pembacaan dilakukan secara sistematika, dan setiap lapang pandang dilihat, bakteri Mycobacterium tuberculosis berwarna merah berbentuk batang lurus atau bengkok, terpisah, berpasangan atau berkelompok dengan latar belakang biru (Supriyadi, 2003)
Lihat disini cara menggunakan mikroskop
b. Gen
Expert
Tes cepat molekuler GeneXpert MTB/RIF merupakan
pemeriksaan molekuler menggunakan catridge berdasarkan Nucleic Acid Amplification
Test (NAAT) yang secara otomatis mendeteksi M.tuberculosis dan sekaligus
mendeteksi resistensi M.tuberculosis
terhadap rifampisin.
Rifampisin merupakan penanda pengganti
(surrogate marker) yang mewakili suatu MDR-TB , dibuktikan dari beberapa hasil
penelitian yang menyatakan lebih dari 90% penderita TB yang resisten
rifampisin, juga mengalami resistensi terhadap isoniazid36-39. Gen rpoB
mengkode subunit-β ribonucleic acid (RNA) polimerase yang bekerja berikatan
dengan rifampisin, yang merupakan komponen penting dalam proses transkripsi.
Sintesis Protein akan terhambat disebabkan terhambatnya transkripsi RNA
tersebut. Bila terjadi mutasi pada gen rpoB, akan terjadi resistensi rifampisin
dimana obat rifampisin tidak dapat berikatan dengan subunit-β RNA polimerase.
Beberapa peneliti mendapatkan >95% isolat M. tuberculosis yang resisten
terhadap rifampisin mengalami mutasi pada gen rpoB, sehingga regio ini
merupakan target yang ideal untuk memeriksa resistensi rifampisin secara molecular
Sistem GeneXpert diluncurkan tahun 2004
dimana pemeriksaan ini menggunakan metode heminested real-time polymerase chain
reaction (PCR) assay untuk mendeteksi mutasi pada regio hot spot rpoB, kemudian
diperiksa dengan beacon molecular sebagai probe. Pengujian dilakukan pada platform
tes cepat molekuler GeneXpert MTB/RIF, mengintegrasikan sampel yang akan diolah
dalam cartridge plastik sekali pakai dan secara automatis mendeteksi melalui 3
proses yaitu persiapan sampel, amplifikasi dan deteksi. Cartridge ini berisi
semua reagen yang diperlukan untuk dapat melisiskan bakteri, ekstraksi asam
nukleat, amplifikasi, dan deteksi gen yang sudah diamplifikasi. Pemeriksaan ini
tidak memerlukan tenaga ahli yang khusus karena pemeriksaan ini bersifat
otomatis dan hasil dapat diperoleh kurang dari 2 jam.
Sputum yang terkontaminasi dicampurkan dengan
reagen sampel (RS) yaitu berupa natrium hidroksida dan isopropanolol. RS
ditambahkan ke sampel dan diinkubasi pada suhu kamar selama 15 menit. Langkah
ini dirancang untuk mengurangi kelangsungan hidup M. tuberculosis di sputum
setidaknya 106 kali lipat untuk mengurangi risiko Biohazard. Sampel yang telah
dicampur dengan SR tersebut kemudian secara manual ditransfer ke cartridge
kemudian dimasukkan ke dalam mesin. Pengolahan selanjutnya sepenuhnya otomatis
(Danusantoso, 1999)
Sampel yang secara otomatis diputar dan di
filter sehingga M.Tb akan terpisah dari sampel sputum. Kemudian inhibitor
mencuci sel organisme yang ditangkap dengan buffer kemudian platform akan
melisiskan menggunakan sumber energi ultrasonik sehingga DNA dari M.Tb akan
terlepas dan dialirkan melalui saringan membran. Lalu DNA dicampur dengan
reagen PCR kering dan dipindahkan ke dalam tabung reaksi untuk amplifikasi dan
dideteksi
Dalam salah satu laporan penelitian, sampel
sputum pasien non-TB ditambahkan kuman M.Tb 10-300 CFU/ml sputum kemudian
dilakukan tes cepat molekuler GeneXpert MTB/RIF, ditemukan batas terdeteksi
kuman adalah 131 CFU/ml sputum. Bila dibandingkan dengan pemeriksaan apusan
langsung sputum yang diperkirakan memiliki batas terdeteksi 10.000 CFU/ml
sputum dan batas terdeteksi pada kultur diperkirakan 10-100 CFU/ml sputum. Hal
tersebut membuktikan bahwa tes cepat molekuler GeneXpert MTB/RIF memiliki sensitivitas
lebih besar dari pemeriksaan apusan sputum dan memiliki sensitivitas yang
mendekati pemeriksaan kultur
Menurut laporan penelitian lainnya, pada sampel sputum
ditambahkan 20 jenis NTM yang telah di isolasi (termasuk 16 spesies yang
menyebabkan penyakit pada manusia). kemudian dilakukan tes cepat molekuler
GeneXpert MTB/RIF dan didapatkan hasil negatif pada semua sampel. Hal ini
membuktikan bahwa GeneXpert memiliki spesifisitas yang cukup tinggi. Akan
tetapi apabila dilakukan percobaan dimana sampel sputum ditambahkan NTM dalam
konsentrasi tinggi lalu dicampur kuman M.Tb dalam konsentrasi rendah tes cepat
molekuler GeneXpert MTB/RIF mengalami penurunan sensitivitas.
TERIMAKASIH SUDAH BERKUNJUNG KE BLOG KAMI ^^
0 Comments
