22.18
Berikut ini menjelaskan tentang
Cara isolasi kapang Aspergillus spp, cara identifikasi kapang Aspergillus spp, cara pembuatan gel SDS-PAGE, cara running SDS-PAGE
1.
Isolasi
Kapang Aspergillus spp
Isolasi
kapang Aspergillus spp dilakukan pada media PDA (Potato Dextrose Agar)
sintesis dengan menggunakan cawan petri :
1. Disiapkan
alat dan bahan.
2.
Ditimbang media PDA sebanyak
5,85 gr lalu dipindahkan kedalam erlenmeyer kemudian ditambahkan aquadest
sebanyak 150 mL
3.
Dihomogenkan larutan dengan
cara dipanaskan dan diaduk selama proses pemanasan sampai mendidih diatas hot plate
4.
Disterilisasi media yang
telah dibuat pada suhu 121oC selama + 15 menit
5.
Dikeluarkan media PDA dan
diletakan dalam laminar air flow
6.
Dipipet 900 µL aquadest lalu
ditambahkan 100 µL sampel ditabung eppendorf, homogenkan
7.
Dituang sampel kedalam cawan
petri bersamaan dengan medianya, dihomogenkan membentuk angka 8
8.
Dibiarkan media sampai
memadat dengan sempurna didalam cawan petri
9. Diinkubasi media kedalam inkubator pada suhu 37oC pada posisi terbalik selama 24 jam.
2.
Idetifikasi
Kapang Aspergillus spp
Identifikasi
kapang Aspergillus flavus dilakukan
dengan cara makroskopis. Identifikasi jamur secara makroskopis dengan cara
melihat warna koloni jamur, tekstur koloni, zonasi koloni, dan bentuk koloni.
3.
Pemeriksaan dengan SDS-PAGE
Pemeriksaan yang
dilakukan pada penelitian ini adalah sebagai berikut :
a. Preparasi
Sampel
1. Diukur
konsentrasi sampel dengan menggunakan metode Bradford atau Lowry.
2. Setelah
diperoleh konsentrasi yang diinginkan maka tahap berikutnya adalah dengan
menambahkan sampel buffer yaitu laemmli sampel buffer yang sudah ditambahkan
(50 µL β- mercaptoetanol + 950 µL laemmli sampel buffer) sebanyak 1:1
3. Selanjutnya,
protein yang sudah ditambahkan laemmli sampel buffer dipanaskan dalam water bath atau heat block (>70oC) selama 3-5 menit untuk
mendenaturasi protein dan mempercepat reaksi pada sampel yang dianalisis.
4. Setelah dingin, disimpan pada suhu 20ºC bila sampel tidak langsung dipakai.
b. Pembuatan Gel SDS-PAGE
1. Disiapkan
alat yang akan digunakan untuk mencetak gel seperti spacer plate, short plate, dan casting
gel system.
2. Dirakit
alat untuk membuat gel, dengan memasukkan spacer
dan short plate pada casting gel
secara merata untuk menghindari kebocoran.
3. Pertama
dibuat larutan gel pemisah (separating
gel) 12% dengan komposisi sebagai berikut:
- Dimasukkan
3 mL stock 30% akrilamide/Bis dalam tabung.
- Ditambahkan
1,875 mL 1,5 M tris pH 8.8 kedalam tabung, shaker perlahan- lahan.
- Ditambahkan
aquabides 5,03 mL, shaker perlahan-lahan kembali.
- Ditambahkan
75 µL 10% SDS (Sodium Dodecyll Sulphate),
shaker kembali.
- Dimasukkan
38 µL 10% APS (Amonium Sulphate).
- Ditambahkan
TEMED 3,8 µL, shaker kembali.
- Segera
dituangkan kedalam cetakan, ditunggu hingga ± 30 menit.
4. Dibuat larutan untuk stacking gel 4%, dengan komposisi sebagai berikut:
- Dimasukkan
500 µL 30% Akrilamide/Bis dalam tabung.
- Ditambahkan
945 µL 0,5 M tris pH 6,8, shaker perlahan-lahan.
- Ditambahkan
aquabides 2,250 mL, shaker perlahan-lahan kembali.
- Ditambahkan
38 µL 10% SDS (sodium dodesil sulfate),
shaker kembali.
- Dimasukkan
20 µL 10 % APS (Amonium persulfate).
- Ditambahakan
TEMED 3,8 µL, shaker kembali.
- Segera
dituangkan diatas separating gel.
- Dipasang
comb, dan ditunggu hingga gel
memadat.
- Setelah gel membeku, gel siap
digunakan untuk proses SDS-PAGE.
c.
Running SDS-PAGE
1. Dimasukkan
gel yang telah dibuat ke dalam chamber
yang terdapat pada mini protein tetra cell, ditambahkan running buffer kemudian comb dibuka.
2. Sampel
protein dan marker dimasukkan ke dalam sumur/well.
3. Setelah
marker protein dan sampel protein dimasukkan, ditutup chamber mini protein tetra
cell. Dihubungkan kabel mini protein tetra cell dengan power supply.
4. Di running
gel pada 100-120 V , selama 60 - 90 menit , kecepatan arus 50 mA.
5. Setelah
selesai, dimatikan power supply, lalu
diangkat kaca yang mengandung gel kemudian dikeluarkan gel menggunakan pembuka
gel yang sudah disediakan.
6. Untuk
verifikasi hasil SDS-PAGE dapat dilakukan dengan proses pewarnaan dengan coomasie ble atau menggunakan coomassie Bio-Safe.
7. Setelah
proses pewarnaan, dilakukan langkah destaining/pencucian
gel. Untuk penggunaan coomasie blue
digunakan larutan destaining dengan komposisi :
- Methanol
100 mL
- Asam
asetat glasial 100 mL
- Aquades
100 mL
- Untuk
penggunaan coomasie bio safe bisa menggunakan aquades.
8. Setelah
itu divisualisasi bisa di lakukan langsung tanpa menggunakan imaging sistem.
0 Comments
