JENIS - JENIS PENGECATAN ATAU PEWARNAAN BAKTERIOLOGI

JENIS - JENIS PENGECATAN ATAU PEWARNAAN BAKTERIOLOGI

    20.11

   

 

   1.      Jenis – jenis bakeri gram + coccus dan basil

No.	Nama Bakteri	Jenis bakteri
1.	Corynebacterium sp.	Basil
2.	Bacillus sp.	Basil
3.	Clostridium sp.	Basil
4.	Bacteriodes sp.	Basil
5.	Mycobacterium sp.	Basil
6.	Nocardia sp.	Basil
7.	Leptospira sp.	Basil
8.	Treponema sp.	Basil
9.	Listeria monocytogenes	Basil
10.	Rhodococcus sp.	Coccus
11.	Staphylococcus sp.	Coccus
12.	Streptococcus sp.	Coccus

     2.      Cara Identifikasi

Media adalah bahan yang terdiri dari campuran zat – zat makanan ( nutrisi ) baik bahan alami maupun bahan buatan, yang diperlukan mikroorgansime untuk perkembangbiakan dilaboratorium secara invitro.

1.      Media selektif adalah media yang kompleks yang sangat selektif, pada perbenihan ini hanya bakteri tertentu yang bisa tumbuh baik sedangkan bakteri lainnya dapat terhambat pertumbuhannya.

2.      Media umum adalah media yang digunakan untuk pertumbuhan satu atau lebih  mikroba.media ini mengandung zat/bahan yang sederhana sehingga untuk keperluan diagnostic tidak digunakan dilaboratorium.

3.      Media differensial adalah media yang karena komposisi kimiawi dapat memperlihatkan perbedaan hasil metabolic sebagai akibat pertumbuhan bakteri pada perbenihan tersebut, sehingga dapat dibedakan kelompok atau spesies dari bakteri yang bersangkutan.

4.      Transport media adalah media yang digunakan untuk mengirim specimen dari suatu tempat ke laboratorium media yang digunakan untuk mencegah agar bakteri yang ada dalam specimen tidak mati dan tidak mengadakan  multiplikasi apabila pemeriksaan ditunda.

5.      Media enrichment adalah media yang ditambahkan faktor –faktor pertumbuhan seperti darah, vitamin, ekstrak ragi sehingga bakteri yang sulit tumbuhkan dapat dibiak pada media ini.

    3.      Pengecatan 

  Ø  Jenis – Jenis Pengecatan

1. Pengecatan progresif

Disebut juga pengecatan direct atau monochromatis yaitu pengecatan yang menggunakan satu macam cat saja, misalnya pengecatan sederhana. Perbedaan warna cel – cel atau bagian – bagian cel tergantung dari besar     kecilnya kemampuan cel atau bagian cel menyerap cat yang diberikan.

·         Cat – cat yang digunakan :

Solutio fuchsin, carbol fuchsin, solutio methylen biru, loeffler methylen biru,    carbol gentian violet dan sebagainya.

2. Pengecatan regresif

Disebut juga pengecatan contrast/indirect, yaitu pengecatan yang menggunakan  lebih dari satu macam cat dan juga di gunakan bahan – bahan peluntur. Cat – cat dan bahan peluntur ini dipilih dengan tepat, supaya di peroleh hasil     pengecatan yang baik, antara badan bacteri (spora, kapsul) serta cel – cel yang     lain warnanya jelas berbeda.

·         Contoh – contoh pengecatan :

Gram, ziehl neelson, kinyoun gabbett, neisser, burry gins, klein dan sebagainya.

3. Pengecatan majemuk

Adalah pengecatan yang di lakukan dengan satu campuran cat yang terdiri dari     2 atau 3 jenis cat yang terlarut. Pada pengecatan ini bermacam – macam cat itu bekerja bersamaan terhadap cel, jaringan atau bagian – bagian cel, sesuai     dengan affiniteitnya masing – masing sehingga di peroleh hasil yang berbeda –     beda.

·         Contoh – contoh pengecatan :

Wright, giemsa, kiewiet de yong.

  Ø  Cara – Cara Pengecatan

I. Pengecatan Sederhana

    A. Cat – cat yang di gunakan :

            1. solutio methylen biru

                1 gram methlyen

                 100 ml aquadest

                 Lamanya pengecatan sampai 2 menit

            2. loeffler methylen biru

                100 ml solutio methylen biru

                1 ml kalium hydroksida 1%

                Lamanya pengecatan 1 menit

            3. manson methylen biru

                0,2 gram methylen biru

                0,5 gram borax

                100 ml aquadest

                Lamanya pengecatan 1 menit

            4. selain itu dapat pula di gunakan cat Gram A, Ziehl Neelson A.

    B. Pelaksanaan pengecatan :

            1. Sediaan yang sudah kering, difixer, ditaruh di jembatan pengecatan.

            2. Genangi dengan salah satu cat tsb, diatas di tunggu sesuai dengan batas                 waktunya

            3. Cat di buang, dicuci dengan air mengalir sampai bersih

            4. Keringkan dengan tissue, kertas saring atau diatas api seperti pada                 pembuatan sediaan atau dibiarkan kering dengan sendirinya.

            5. Siap dilihat dengan microscop objektif 100X.

   C. Hasil Pengecatan:

       Bacteri dan Cel lain akan berwarna biru/violet tergantung cat yang digunakan.

II. Pengecatan Gram

    A. Cat yang di gunakan :

            1. Gram A :

                 2 gram crystal violet

                 20 ml alkohol 95%

                 0,8 ammonium oksalat

                 80 ml aquadest

            2. Gram B (lugol) :

                1 gram yodium

                2 gram kalium iodida

                300 ml aquadest

            3. Gram C (bahan pelarut)

                50 ml aceton

                50 ml alkohol 95%

            4. Gram D :

                0,25 gram safranin

                10 ml alkohol 95%

                90 ml aquadest.

    B. Pelaksanaan pengecatan :

            1. Sediaan yang sudah difixier, digenangi dengan cat Gram A, sampai                 menutupi seluruh sediaan, diamkan 1 menit.

            2. Cuci dengan air sebentar

            3. Genangi dengan Gram B selama 1 menit

            4. Cuci dengan air sebentar

            5. Larutkan warnanya dengan menggenangi  sediaan dengan Gram C                 selama ± 30 detik, sampai tidak kelihatan adannya merah yang luntur

            6. Cuci dengan air sebentar

            7. Genangi dengan Gram D selama 30 detik

            8. Cuci dengan air sampai bersih keringkan, siap dilihat di mikroskop.

     C. Hasil Pengecatan : 

            Gram ( + ) : berwarna violet

            Gram ( - )  : berwarna merah

     D. Proses Pengecatan :

·         Pada pengecatan dengan Gram A semua bacteri berwarna violet

·         Pada pengecatan dengan Gram B terjadi perubahan, yang tadinya berwarna violet berubah menjadi violet tua – hitam

·         Pada pelunturan dengan Gram C, bacteri Gram ( + ) tetap berwarna violet sedangkan ( - ) menjadi tidak berwarna/pucat.

·         Pada pengecatan dengan Gram D, bacteri yang Gram ( + ) tetap berwarna violet sedangkan bacteri yang Gram ( - ) akan berwarna merah oleh safranin 0 didalam Gram D.

III. Pengecatan Bta Menurut Ziehl Neelson

       A. Cat yang digunakan :

            1. Ziehl Neelson A :

                10 ml 3% alcohol fuchsin

                90 ml 5% phenol

            2.  Ziehl Neelson B :

               3 ml asam chlorida pekat (37%)

               97 ml alcohol 95%

            3. Ziehl Neelson C :

               0,1 gram methylen biru

               100 ml aquadest

        B. Pelaksana pengecatan :

            1. Sediaan yang sudah difikasi, diletakkan pada jembatan pengecatan,            digenangi dengan ZN.A.Lewatkan nyala api spiritus dibawah sediaan,                 sampai selalu keluar uapnya, tetapi jangan sampai mendidih/kering,                 selama 5 menit.

            2. Cat di buang dicuci dengan air mengalir

            3. Larutkan warna merah pada sediaan samapi bersih, dengan ZN.B. (asam                 alkohol)

            4. Cuci dengan air mengalir

            5. Genangi sediaan dengan zat ZN.C. (methylen biru), selama 20-30 detik

            6. Cuci dengan air mengalir, keringkan.

       C. Hasil Pengecatan :

            BTA ( + )        : Bacteri tahan asam positif : berwarna merah

            BTA ( + )        : Bacteri tahan asam negatif : berwarna biru

       D. Proses pengecatan :

·         Pada pengecatan dengan carbol fuchsin dan dipanaskan, selubung lemak pada BTA terbuka, cat masuk ke dalam badan bacteri. Bacteri yang tidak tahan asam dengan mudah menyerap cat, dengan pemanasan atau tidak. Semua bacteri ( BTA dan BTTA ) berwarna merah.

·         Pada waktu di cuci dengan air, selubung lemak pada BTA  tertutup kembali, sehingga waktu di larutkan dengan asam alcohol BTA tetap berwarna merah dan BTTA berwarna pucat / jernih

·         Pada pengecatan dengan methylen biru, BTA tetap berwarna merah sedangkan BTTA berwarna biru.

IV. Pengecatan Bta Menurut Kinyoun Gabbett :

      A. Cat yang digunakan :

            1. Kinyoun :

                4 gram basic fuchsin

               8 ml phenol liquid

               20 ml alcohol 95%

               100 ml aquadest

            2. Gabbett :

                1 gram methylen biru

                20 ml asam sulfat p.a.

                30 ml alcohol absolut

                50 ml aquadest

        B. Pelaksanaan pengecatan :

            1. Sediaan yang sudah difiksasi digenangi dengan cat kinyoun selama 3           menit

            2. Cuci dengan air mengalir sampai bersih

            3. Genangi dengan cat Gabbett selama 1 menit

            4. Cuci dengan air mengalir sampai bersih, keringkan. 

        C. Hasil pengecatan :

            Bacteri tahan asam berwarna merah sedangkan bacteri yang tidak tahan      asam berwarna biru.

        D. Proses pengecatan :

·         Pengecatan dengan cat kinyoun, semua bacteri berwarna merah. Masuknya cat fuchsin ke dalam badan bacteri tahan asam dipengaruhi oleh phenol, alcohol dan tingginya kadar cat.

·         Pengecatan dengan cat Gibbett terjadi 2 proses, yaitu :

a) pelarutan warna merah dari fuchsin, yang ada pada badan bacteri tidak     tahan pada asam, menjadi pucat.

b) pengecatan bacteri yang tidak tahan asam yang tadinya pucat menjadi      biru

·         Bacteri yang tahan pada asam tidak terpengaruh oleh cat Gabbett sehingga tetap berwarna merah

V. Pengecatan Bta Dengan Fluorochrome

     A. Cat yang digunakan :

            1. Aurame phenol :

                100 ml larutan phenol 3%, hangatkan.

                0,3 gram auramine 0.

                Campurkan dikocok baik – baik sampai larut, kemudian disaring.

            2. Asam alcohol :

               1 ml asam chorida 37%

               99 ml alcohol absolut

            3. Kalium permanganat :

               0,1 gram kalium permanganat

               100 ml aquadest

     B. Pelaksanaan pengecatan :

            1. Sediaan yang sudah difiksasi, digenangi dengan auramine phenol                 selama 10 menit

            2. Cuci dengan air mengalir

            3. Genangi dengan asam alcohol selama 5 menit

            4.  Cuci dengan air mengalir

            5. Genangi dengan kalium permanganat selama 30 detik

            6. Cuci dengan air mengalir, keringkan

     C. Hasil pengecatan :

            Sediaan yang sudah dicat, dan sudah kering, dilihat dengan microscop       fluorescent pembesaran objectif 10 X kemudian 20/40 X

            Bacteri tahan asam berwarna kuning berpendar ( berfluoresensi ), bacteri     tidak tahan asam tidak kelihatan.

     D. Proses pengecatan :

·         Pada pengecatan dengan auramine phenol, semua bacteri akan berwarna kuning oleh auramine

·         Pelarutan dengan asam alcohol, BTA tidak melepaskan warna kuning sedangkan BTTA akan melepaskan warna kuning auramine, sehingga menjadi pucat

·         Pengecatan dengan kalium permanganat tidak mewarnai BTA maupun BTTA tetapi memberi warna latar belakang sediaan, sehingga warna kuning auramine akan lebih jelas.

VI.   Pengecatan Granula Methacromatis Menurut Neisser

1. Cat yang digunakan :

1.      Nisser A :

0,1 gram methylen biru.

2  mL alcohol absolute.

5 mL asam asetat pekat.

95  mL aquadest.

2.      Neisser B :

0,2 gram bismark brown.

100 mL aquadest.

2. Pelaksanaan pengecatan :

1.      Sediaan digenangi dengan Neisser A selama 60 detik.

2.      Cuci dengan aquadest.

3.      Genangi dengan Neisser B selama 10 detik.

4.      Cuci dengan aquadest.

5.      Keringkan udara, perika dengan mikroskop.

3. Hasil pengecatan :

Granula diujung badan bakteri akan berwarna biru oleh methylen biru dan badan bakteri berwarna kuning atau coklat.

4. Proses pengecatan :

-          Pada pengecatan dengan Neisser A, granula berwarna  biru tua, badan bakteri berwarna biru muda.

-          Dicuci dengan aquadest, granula berwarna biru, badan bakteri tidak berwarna.

-          Pengecatan dengan Neisser B, memberikan warna cokla/kuning kepada badan bakteri.

VII.   Pengecatan Granula Metacromatis Menurut Leffler

1. Cat yang digunakan :

Loeffler methylen biru :

·         0,3 gram methylen biru

·         30 mL alcohol  95 %

·         0,1 mL potassium hydroksida 10 %

2. Pelaaksanaan pengecatan :

1.      Sediaan digenangi cat Loffler  methylen biru selama 1-2 menit.

2.      Cuci dengan aqudest.

3.      Keringkan di udara, periksa dengan mikroskop.

VIII.   Pengecatan Granula Metachromatis Menurut Albert Dan Christensen

1. Cat yang digunakan :

1.      Larutan toluidine biru

0,15 gram toluidine 95%.

2 mL alcohol 95%.

5 mL asam asetat pekat.

100 mL aquadest.

2.      Larutan Yodium  (lugol)

0,3 gram yodium.

0,6 gram kalium yodida.

100 mL aquadest.

3.      Larutan Safranin

0,75 gram safranin 0.

5 mL alcohol 95%

95 mL aquadest

2. Pelaksanaan pengecatan :

1.      Sediaan digenangi dengan toluidine selama 1 menit.

2.      Cuci dengan air, isatkan.

3.      Dialiri dengan larutan yodium.

4.      Cuci dengan air, isatkan.

5.      Genangi dengan larutan safranin 0 selama 1 menit.

6.      Cat dibuang, isatkan, biarkan kering diudara.

3. Hasil pengecatan :

Granula metachromatis berwarna hitam, badan bakteri berwarna merah.

IX.  Pengecatan Kapsul Bakteri Menurut Burry Gins

1. Cat yang digunakan :

1.      Tinta cina/tita india

2.      Solution fuchsin/safranin

0,25 gram basic fuchsin/safranin

100 mL aquadest.

2. Pelaksanaan pengecatan :

1.      Pada ujung sebelah kanan dari objek glass yang bersih dan bebas lemak, dibuat suspense bakteri dengan 1 ose air garam.

2.      Pada suspense itu ditambahkan 1 ose tinta cina, campur sampai homogen.

3.      Dengan objek glass yang lain campuran itu dibuat sediaan apus= malit= tipis.

4.      Dibiarkan kering diudara.

5.      Digenang dengan cat solutio fuchsin selama 1 menit.

6.      Cat dibuang, sediaan di keringkan diudara dengan posisi miring, atau diserap dengan kertas saring/tisu.

3. Hasil pengecatan :

Kapsul bakteri tidak berwarna, badan bakteri berwarna merah, latar belakang sedikit hitam.

4. Proses pengecatan :

-          Penambahan tinta cina pada suapensi bakteri akan member warna ke badan bakteri dan kapsulnya, tetapi member warna pada objek glassnya.

-          Pengecatan denga solutio fuchsin, member warna merah kepada badan bakteri sedangkan kapsulnya tidak, begitu pula latar belakangnya.

X.  Pengecatan Kapsul Bakteri Menurut Mac Neal

1. Cat yang digunakan :

1.      Mac Neal tetrachrome :

1 gram eosin yellowish

1 gram methylen biru

0,6 gram azure II

0,2 gram methyl violet

1000 mL methyl alcohol

Panaskan 50⁰C 30 menit, simpan 37⁰C 2 hari, tiap hari di kocok beberapa kali,saring dengan kertas saring.

2. Pelaksanaan pengecatan :

1.      Buatlah sediaan yang tipis dari sampel yang akan di periksa. Biarka kering diudara.

2.      Genangi dengan Mac Neal tetrahrome selama 3-5 menit.

3.      Cuci dengan aquadest, keringkan diudara, periksa dengan mikroskop.

3. Hasil pengecatan :

Kapsul bakteri tidak berwarna /pucat, badan bakteri berwarna merah-violet.

XI.  Pengecatan Spora Bakteri Menurut Wirtz Conklin

1. Cat yang digunakan :

1.      Solutio  malachiete green

5 gram malachiete green

100 mL aquadest

2.      Solutio safranin

0,5 gram safranin

100 mL aquadest

2. Pelaksanaan pengecatan :

1.      Sediaan tipis digenangi dengan solutio malachite green dan panasi sampai selalu keluar uapnya selama 3-6 menit.

2.      Cuci dengan aquadest.

3.      Genangi dengan solutio safranin selama 30-60 menit.

4.      Cuci dengan aquadest.

5.      Keringkan, periksa dengan mikroskop.

3. Hasil pengacatan :

Spora berwarna hijau, badan bakteri kemerah-merahan.

XII.  Pengecatan Spora Bakteri Menurut Klein

1. Cat yang digunakan:

1.      Ziehl Neelson A (carbol fuchsin)

2.      Asam sulfat 1 %

3.      Ziehl Neelson C ( solutio methylen biru).

2. Pelaksanaan pengecatan :

1.      Sediaan ditempatkan pada jembatan pengecatan.

2.      Genangi dengan ZN.A sampai semua permukaan sediaan yang ada sampelnya tertutup dengan cat.

3.      Dibawah sediaan dilewatkan nyala api spritus sampai selalu keluar  uapnya, jangan sampai mendidihselama 5 menit.

4.      Cuci dengan air mengalir.

5.      Cuci dengan asam sulfat 1 %  sampai sediaan kelihatan sedikit rose.

6.      Cuci dengan air mengalir.

7.      Genangi dengan ZN.C selama 2 menit.

8.      Cuci dengan air mengalir sampai bersih, keringkan, periksa dengan mikroskop.

3. Hasil pengecatan :

Spora bakteri berwarna merah, badan bakteri berwarna biru.

4. Proses pengecatan :

-          Pada pemeriksaan dengan ZN.A semua bagian  bakteri  berwarna merah.

-          Pencuian dengan asam sulfat melarutkan warna merah pada badan bakteri, sedangkan spora bakterinya tetap berwarna merah(spora tahan asam).

-          Pengecatan dengan ZN.C member warna biru kepada badab bakteri, spora tetap merah.

XIII.  Pengecatan Polair Bakteri Menurut Weyson

 Biasanya untuk melihat polair bakteri Y.pestis dari klinikal specimen atau organ-organ tikus.

1. Cat yang digunakan :

Weyson stein terbuat dari :

0,2 gram basic fuchsin

0,7 gram methylen biru

10 mLmethanol

Basic fuchsin metilen biru dilarutkan didalam methanol, kemudian ditambah phenol 5 % di dalam aquadest sampai 200 mL.

2. Pelaksanaan pengecatan :

1.      Sediaan yang sudah kering diudara, difiksasi dengan melewatkan nyala api spritus 3x, atau digenangi dengan methanol selama 3 menit, keringkan.

2.      Sediaan digenangi dengan cat Weyson selama 1 menit.

3.      Cuci dengan air mengalir

4.      Keringkan, lihat denga mikroskop

3. Hasil pengecatan :

Polair bakteri Y.pestis berwarna biru kemerah-merahan, badan bakteri tidak berwarna.

XVI.  Pengecatan Flagella Menurut Leifson

1. Cat yang digunakan :

1.      Leifson A :

0,5 gram fuchsin (bersertifikat untuk pengecatan flagella)

50 mL alcohol 95 %

Kocok, diamkan semalam supaya larut.

2.      Leifson B :

1,5 gram tannic acid.

0,75 gram sodium chloride

100 mL aquadest

Kalau akan digunakan A dan B dicampur, sisanya boleh disimpan didalam almari es 4-5⁰C selama sampai 2 bulan.

2. Pelaksanaan pengecatan :

1.      Kedalam 3-5 mL aquadest didalam tabung reaksi, tambahkan 1 ujung ose koloni bakteri yang di ambil dari kultur bakteri pada BHI agar/TS agar umur 18 jam 30⁰C. campur pelan-pelan sampai homogan.

2.      Teteskan 1 tetes suspense itu pada salah satu ujung objek glass, tegakkan pada raknya sehingga terjadi aliran kebawah suspense itu. Biarkan kering diudara.

3.      Genangi dengan campuran cat tersebut di atas selama 5 menit, sampai kelihatan kehijau-hijauan pada ujung/tepi tetesan , jangan sampai kering.

4.      Cat dibuang, dicuci dengan air, keringkan, lihat dengan mikroskop.

3. Hasil pengecatan :

Flagella dan bakteri berwarna merah.